三聚氰胺檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)奶粉、牛奶、組織、飼料、蛋類、血清等樣本中的三聚氰胺（Melamine，MEL），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的三聚氰胺和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗三聚氰胺抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含三聚氰胺含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中三聚氰胺的殘留量。
2 三聚氰胺檢測(cè)試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：2ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測(cè)下限：
奶粉……………………………………40ppb
牛奶……………………………………54ppb
牛奶/奶粉（處理法二）………………2ppb
組織（雞/豬/鴨/魚(yú)/蝦/肝臟）………4ppb
飼料……………………………………200ppb
蛋類……………………………………40ppb
血清……………………………………8ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
三聚氰胺………………………………100%
三聚氰酸………………………………60%
三嗪、三嗪二銨………………………<1%
 2.5 樣本回收率：
牛奶、奶粉………………………90%±20%
組織………………………………85%±20%
飼料………………………………85%±20%
蛋類………………………………80%±20%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml
0ppb、2ppb、6ppb、18ppb、54ppb、162ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：1ppm…………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說(shuō)明書(shū)………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、正己烷、甲醇 
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：1M HCl 溶液
    取8.6ml濃HCl加去離子水至100ml。
配液2：乙腈-0.1M NaOH溶液 
    84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻。
配液3：0.1M NaOH 溶液
    稱取0.4g NaOH加去離子水至100ml。
配液4：1M NaOH 溶液
    稱取4g NaOH加去離子水至100ml。
配液5：復(fù)溶液
    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 牛奶樣本處理方法：
1）取牛奶樣本600µl到2ml的離心管中，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻；4000r/min離心5min；
2）取100µl上清液，加入900µl復(fù)溶液，混勻；
3）取50 µl用于分析。
牛奶樣本稀釋倍數(shù)：27    檢測(cè)下限：54ppb
5.3.2 奶粉樣本處理方法：
1）稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇，充分振蕩；
2）4000r/min離心10min，取100µl上清液，再加入900µl復(fù)溶液，混勻；
3）取50µl用于分析。
奶粉樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測(cè)下限：40ppb
5.3.3 牛奶/奶粉樣本處理方法二：
1）取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中；
2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取4ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50µl用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：2ppb
5.3.4 組織（雞/豬/鴨/魚(yú)/蝦/肝臟）樣本處理方法：   
1）取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中；
2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取2ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50µl用于分析。
     樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測(cè)下限：4ppb
5.3.5 飼料樣本處理方法：
1）將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去離子水均質(zhì)；
2）旋流1min，放振蕩器上振蕩2min；
3）4000r/min離心15min，取出10ml上清液并用1M NaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼料樣品的不同，加入1M NaOH的量有所差異，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）
4）4000r/min 離心15min，吸出上清液（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾）；
5）取上清液用復(fù)溶液10倍稀釋（取100µl上清液加入900µl復(fù)溶液，混合均勻）；
6）取50µl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：100    檢測(cè)下限：200ppb
5.3.6 蛋類樣本處理方法：   
1）用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）；
2）稱取2.0±0.05g均質(zhì)過(guò)的樣本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min；（蛋清含蛋白成份高，加入提取液后會(huì)形成一團(tuán)膠狀物，較蛋黃或全蛋難搖勻，此情況為正常現(xiàn)象不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）
3）4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；  
4）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
5）取下層水相用復(fù)溶液4倍稀釋（50µl樣本液加150µl復(fù)溶液），混合30s；
6）取50µl用于分析。
 樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測(cè)下限：40ppb
5.3.7 血清樣本處理方法：   
1）取0.5ml血清樣本于50ml離心管中；
2）加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml復(fù)溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測(cè)下限：8ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索取）
8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。